Modul "Transformation beim Bakterium [E.coli]"

Hintergrund:	1973 wurde das erste Gen auf ein fremdes Lebewesen übertragen. Seitdem sind zahlreiche solche Transformationen bei unterschiedlichen Lebewesen vorgenommen worden. Die dazu eingesetzten Methoden sind vielfältig. In diesem Modul wird auf der Basis von "Blue Genes" (Fonds der chemischen Industrie; ROCHE) eine Transformation bei E.coli (JM109) vorgenommen. Da hier nicht ein „neues“ Bakterium entsteht, sondern den Bakterien des Sicherheitsstammes nur ihr „altes“ Gen wieder eingesetzt wird, ist dieser Versuch nach dem deutschen Gentechnikgesetz an Schulen erlaubt.
Zielsetzung:	Dem Bakterium E.coli (Sicherheitsstamm K12 / JM 109) wird das Gen lacZ, das dem Stamm JM109 fehlt, zusammen mit der Resistenz gegen Ampicillin wieder eingesetzt (Transformation). Das Bakterium besitzt dann eine Resistenz gegen Ampillicin und kann das Enzym ß-Galactosidase bilden. Dieses Enzym spaltet Laktose. Es kann jedoch auch das synthetische X-Gal (5-Brom-4-chlor-indolyl-ß-D-galaktosid) spalten, was dazu führt, dass ein blauer Farbstoff entsteht. Deshalb bilden Bakterien, die das lacZ-Gen aufgenommen haben und exprimieren, auf Nährböden mit X-Gal blaue Kolonien.
Durchführung:	1. Restriktion: Hier wird das Plasmid pUCD (enthält die Resistenz gegen Ampicillin) mit den beiden Restriktionsenzymen Bam H I und Hin d III zusammengebracht. Das Plasmid wird durch die Enzyme an zwei Stellen geschnitten und es bilden sich "sticky ends". 2. Ligation: Das aufgeschnittene Plasmid und das ebenfalls mit den Enzymen herausgeschnittene Gen lacZ werden zusammengebracht und binden an den "sticky ends" mit Hilfe des Enzyms Enzyms T4 DNA-Ligase aneinander. So entsteht ein größeres Plasmid mit der Ampicillin-Resistenz und dem lacZ-Gen 3. Transformation: Bakterien und um das Gen erweiterte Plasmide werden zusammengegeben. Durch Termperaturschocks und Salze wird die Bakterienwand und -membran durchlässig für das Plasmid. Das Plasmid gelangt in die Zelle. 4. Selektion: Nun werden die Bakterien auf verschiedene Nährböden (mit und ohne Ampicillin, mit und ohne den zu spaltenden Stoff) gegeben, damit die Bakterien selektiert werden können, bei denen die Transformation mit dem erweiterten Plasmid erfolgt ist. Diese bilden blaue Kolonien auf den Nährböden mit Ampicillin und X-Gal.
Ausblick:	Der Versuch ist sehr gut geeignet, das Prinzip der Transformation praktisch erleben zu lassen. Allerdings sollten die Schüler sich vorher ausgiebig mit der Theorie und der Versuchsdurchführung vertraut machen.

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